Il rilevamento non invasivo di carenza di ferro per la misurazione della fluorescenza della zincoprotoporfirina eritrociti labbro: Nature Communications: la ricerca della natura, misure di fluorescenz 

Il rilevamento non invasivo di carenza di ferro per la misurazione della fluorescenza della zincoprotoporfirina eritrociti labbro: Nature Communications: la ricerca della natura




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misure di fluorescenza in maniera non invasiva

Per le misure di fluorescenza, i soggetti seduti davanti all'esaminatore, girando delicatamente il labbro inferiore fuori. L'esaminatore pone la sonda a fibre ottiche nel Vermilion bagnato del soggetto e illuminata Cerca modalità utilizzando un pedale. In questa modalità, gli spettri di fluorescenza sono stati acquisiti continuamente con un tempo di integrazione di 200 ms 407 nm di eccitazione e analizzati per l'assorbimento sangue causato dal suo assorbimento massimo 576 nm ~ (Fig. 3b). il tasso di assorbimento del sangue in un modo è stato determinato che la diminuzione del tessuto di base di circa 576 nm in fluorescenza può essere rimossa dividendo lo spettro di fluorescenza tissutale 10 2 (Fig. 3c), una luce verde è venuto ad indicare che l'esaminatore che l'attuale posizione sul labbro inferiore era adeguata per una determinazione affidabile di sangue rosso zincoprotoporfirina cellule. Per un indice di assorbimento di sangue tra 0,42 10 2 e 0,70 10 2, ha dimostrato una luce arancione; 10 2 e # x000D7 10 2 luci arancioni e rosse; e al di sotto 0,14 10 2, una luce rossa. La sonda a fibre ottiche esaminatore si muoveva lentamente sopra il vermiglio oggetto di una luce verde è stato esposto, in genere ~ 2 3 s. Poi l'esaminatore comincia il processo di misurazione tramite un pedale.

Durante la procedura di misurazione, i 407- e 425 nm diodi laser di eccitazione vengono attivati ​​e spettri di fluorescenza dei tessuti risultanti sono acquisiti con un tempo di integrazione di 200 ms. Per escludere notevoli cambiamenti nelle proprietà ottiche dei tessuti durante questo tempo di integrazione, le misurazioni di riferimento supplementare ad una lunghezza d'onda di eccitazione ed un diodo laser di 520 nm sono state eseguite utilizzando le fibre circostanti nel fascio di fibre (Fig complementare . 2b). Il fascio di fibre è stato collegato ad un fotodiodo che è stato letto con 2.000 campioni ad una velocità di 10 kHz. Nessuna modifica marcate sono state trovate, e queste misure di rinvio non entrano nel calcolo. Infine, tutti i diodi laser sono stati spenti, e uno spettro scuro e il segnale del fotodiodo scuro è stato raccolto con le impostazioni precedenti. Questo ciclo di misura (dopo la modifica delle tre diodi laser infine la disconnessione di tutti i diodi laser) è stato ripetuto 10 volte, con una durata complessiva di 10 s. Tutti i campioni spettri e fotodiodi sono stati memorizzati in formato elettronico.



Durante la procedura di misura 10-s, l'esaminatore mantiene la sonda a fibre ottiche in posizione nel sito del tessuto. Successivamente, l'esaminatore decide se la misura di tale sito era stata effettuata in condizioni controllate, vale a dire che il soggetto non si muoveva e la sonda a fibra ottica non perde il contatto con i tessuti durante la misurazione. In questo caso, la misura viene considerato non valido. La procedura per avviare la modalità di ricerca, l'identificazione di una misurazione sito idoneo, la misurazione viene avviata e poi decidere se la misura è stata eseguita in condizioni controllate è stato ripetuto fino misurazioni valide effettuate 10 a paziente. In generale, qualsiasi misura dovrebbe essere esclusa (in media 0,2 misure esclusi per il soggetto, tra 0 e # x02013, 2, con un totale di 12 valido e 560 erano misurazioni valide). In genere, l'intera procedura di misura sono voluti meno di 5 min. La misurazione del tempo totale netta era ~ 100 s (10 volte per 10 secondi).

valutazione dei dati e dei tessuti spettrale adeguata

Gli spettri di fluorescenza del tessuto acquisite sono state valutate utilizzando MATLAB (versione R2013a, MathWorks Inc., Natick, MA, USA). Dopo la misurazione per ogni soggetto, il totale di 100 spettri eccitato a 425 nm, 100 eccitati 407 nm, e 100 spettri scurErano disponibili. In primo luogo, da ogni spettro di fluorescenza, lo spettro corrispondente viene sottratto scuro. Poi, lo spettro risultante è diviso per il tempo di integrazione, 200 ms, 1 ms spettri sono normalizzati, ottenendo 100 spettri tessuto calibrato per ogni lunghezza d'onda di eccitazione, e . Differenza spettri I viene calcolato dalla normalizzazione spettri di fluorescenza calibrata a x02013 nella gamma di lunghezze d'onda 525 nm e successiva sottrazione. Questi spettri differenza, le caratteristiche spettrali di assorbimento del sangue Ablood () (. Supplementare Figura 3), la fluorescenza del zincoprotoporfirina FZnPP () e protoporfirina IX fluorescenza FPPIX ( ). (Figura 4) sono presenti (Fig. 2a). Queste caratteristiche spettrali sono stati rimossi dagli spettri differenza ottimizzazione dei parametri, P e Z tale che fluorescenza di fondo è stato morbido che rimane nel x02013 lunghezza d'onda e # 560; 750 nm (Fig. 2c). Questo è il caso quando la derivata seconda del fondo con caratteristiche spettrali viene rimosso il più vicino possibile allo zero (Fig. 2b). Questa procedura è illustrata dalla seguente equazione:

Infine, il valore di zincoprotoporfirina per ogni soggetto è stato calcolato come media su 100 misurato per ciascun soggetto. Questi valori sono riportati in Tabella supplementare 1.

HPLC

HPLC è stata eseguita presso il Deutsches Zentrum f Kompetenz- R Porphyriediagnostik und Konsultation, MVZ Labor Dr. Volkmann und Kollegen PD GbR, Karlsruhe, in Germania, con un sistema costituito da una pompa Waters 717 campionatore 515, e Shimadzu RF rivelatore 20 -AL. Knauer uno Nucleosil C18 (250 acetone, 24 metanolo, 20 acqua e 0,02 acido formico (v / v / v)), che è stato fatto funzionare ad una portata di 2,0 ml min 1. La fluorescenza è stato eccitato a 417 nm e rilevata a 635 nm (20 nm di larghezza di banda spettrale). Uno standard di calibrazione (KC2700KA, Immundiagnostik SA, Bensheim, Germania) e due campioni di controllo è stata misurata. campioni EDTA di sangue coagulato dei soggetti in studio 56 sono stati conservati a X000B0 C e misurato in un unico lotto. Dopo lo scongelamento, i campioni sono stati omogeneizzati in un multiaxle miscelatore rotante per almeno 3 min. Poi l soluzione di emolisi (96 acqua e 4 acido formico) e il 1000 l di acetone sono stati agitati per 30 secondi e poi centrifugata a 10.000 rpm Cinquanta microlitri del supernatante è stato iniettato nel sistema HPLC. Per il calcolo del rapporto di zinco protoporphyrin / eme, concentrazione di emoglobina è stata determinata dalle stesse tariffe con XE-2100 analizzatore ematologico Sysmex (Sysmex Corporation, Kobe, Giappone) utilizzando il metodo di SLS (cianuro di sodio lauril solfato ).

Per ridurre al minimo le variazioni intra-saggio, per ciascun soggetto, tre campioni sono stati preparati in base a questo protocollo e zincoprotoporfirina IX e determinate concentrazioni protoporfirina. Per confronto con altri metodi che sono stati utilizzati i valori medi delle misurazioni triplice copia. Inoltre, le variazioni inter-saggio sono stati valutati misurando i tassi delle 56 soggetti in lotti ripetute. Questi lotti sono confrontati in un Bland Altman (vedi complementare Fig. 7).

La valutazione clinica di misure ottiche non invasive

La valutazione clinica di strumento non invasivo è stata effettuata in perinatale Center, Klinikum der Universität M München, Monaco di Baviera, in Germania. Una serie di studi è stato condotto in tre fasi, con 20 soggetti in ciascuna delle prime due fasi di preparazione e di 56 soggetti nell'ultima fase. Per la partecipazione ai criteri di esclusione dello studio sono stati (i) la trasfusione di emoderivati, nel corso della consegna, (ii) una diagnosi di talassemia o anemia falciforme, e (iii) qualsiasi malattia infettiva o infiammatoria acuta o cronica. Tra ogni fase della sperimentazione clinica, ci sono stati miglioramenti strumentali. Ci concentriamo qui sui risultati dell'ultima fase, un periodo di reclutamento da marzo 2014 a dicembre 2014. Per la stima dei limiti CI di accordo tra i metodi non invasivi di HPLC e di riferimento, le dimensioni 56 del campione ha fornito una 95 CI su 0.45s, dove s è la differenza S. D. fra misure effettuate dai due methods42. approvazione etica per lo studio è stato dato dal Istituzionale Consiglio Etico Klinikum der Universität M München (identificatore studio: LFL_01 / 2012, ClinicalTrials.gov identificativo: NCT02310607). consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun soggetto.

Tutte le misure di fluorescenza non invasive sono state eseguite dallo stesso medico durante il ricovero clinicamente indicato entro 3 giorni dopo la consegna. Per ogni problema, abbiamo ci hanno portato fuori 10 non invasivo per ognuno dei 10 siti differenti nelle misurazioni umide del labbro inferiore vermiglio. Adatto per zinco cella ampiezze protoporfirina globuli rossi sono stati in media per ogni soggetto, e regolato alla gamma di valori di intervallo rispetto HPLC. I risultati sono stati confrontati con il segnale / rumore protoporfirina eme zinco misurato con sangue intero metodo HPLC di riferimento per ogni soggetto, come descritto di seguito. Dopo le misurazioni, i partecipanti allo studio hanno avuto un consulto medico per discutere i risultati dei parametri misurati da carenza di ferro nei campioni di sangue.

Aliquote di campioni anticoagulanti residui EDTA-sangue sono rimasti clinicamente indicato anonimato dei campioni di sangue. Due aliquote di 500 X000B0 C e che sono state utilizzate per la determinazione dello zinco protoporphyrin Deutsches Zentrum HPLC a Kompetenz- f R Porphyriediagnostik und Konsultation, l'occupazione PD MVZ Dr. Volkmann und Kollegen GbR. 200 - il tasso è rimasto a 8 C per un massimo di tre giorni, e utilizzato per la determinazione dello zinco protoporfirina rapporto globuli rossi / con un EME haematofluorometer commerciale (modello AVIV 206D Biomedical Inc., Lakewood, NJ, USA) secondo il produttore istruzioni s, utilizzando materiali per il controllo di calibrazione e di qualità da parte del produttore.

analisi statistica dei dat

I valori zincoprotoporfirina misurati con il metodo della fluorescenza non invasivo producono unità arbitrarie. Per confrontare direttamente questi valori con unità HPLC, sono valori di zincoprotoporfirina ridotti. Il fattore di scala è la pendenza di una linea con spostamento origine montato su un confronto tra i valori di protoporfirina zinco e HPLC valori medi delle misurazioni triplice copia (versione software 3.2.0 R, la funzione: pacchetto lmrob: Versione 0.92 robustbase - 3). Bland Altman visualizza la differenza della scala protoporfirina valori zinco e misurazione della media HPLC triplicato rispetto alla media dei due valori. Per confrontare i due metodi, i limiti di accordo e di pregiudizi mostrato in Bland Altman sono stati calcolati utilizzando un robusto scheda SD, -Estimation (Software: R, la funzione: pacchetto scaleTau2: robustbase) delle differenze tra i due metodi, moltiplicato per 1,96. 95 CI sono stati calcolati da bootstrapping (Software: R, le funzioni di: avviare e boot.ci, Pacchetto: boot versione 1.3 a 16). La soglia ottimale per le misure haematofluorometer determinati da analisi del ricevitore caratteristica contro classificazione operativo mediante HPLC (zinco protoporphyrin mol per mole eme; software: R Funzione: optimal.cutpoints, pacchetto: OptimalCutpoints versione 1.1 -3). La sensibilità e la specificità sono state calcolate utilizzando tabelle di contingenza (Software: R, funzione: pacchetto BDtest: BDPV versione 1.1).

simulazioni Monte Carlo

Per studiare l'influenza della geometria del tessuto, i parametri ottici del tessuto e la geometria della sonda a fibre ottiche, sono state eseguite simulazioni Monte Carlo. Queste simulazioni sono state eseguite utilizzando una versione modificata della scheda di un grafico di simulazione applicazione programma Monte Carlo si sovrappongono (MCML) 43, 44, 45, 46. I fotoni rilevati da una o più fibre ottiche, tra la fibra di eccitazione vengono registrate, sommati e normalizzati per il numero di fotoni iniettato.

Il tessuto simulato è costituito da tre strati, l'epitelio, stroma e la superficie stromale inferiore. Le proprietà di superficie e stromale inferiore differiscono solo per il contenuto del sangue. La proprietà ottiche dell'epitelio e stroma variata per garantire che il range fisiologico è coperta (vedi Tabelle supplementari 2 e 3). Per 5a aggiuntivo, anche il contenuto nel sangue di 16 Low stroma simulato. spessore epiteliali è stata variata anche (50, 100, 200 e 400 e # x003BC; m) per ciascuna combinazione di proprietà ottiche nelle tabelle aggiuntive 2 e 3. Lo stroma superficiale era 200 - spessore m, mentre lo spessore dello spessore stromale inferiore è impostato a 10 mm. La fluorescenza è generato nelle lunghezze d'onda di 561 e 576 nm di emissione (autofluorescenza dei soli tessuti) e 593 nm (autofluorescenza dei tessuti e fluorescenza di protoporfirina zinco). zinco protoporphyrin fluorescenza viene generato solo nello stroma sangue perfuso. La quantità di fotoni di fluorescenza generata coefficiente di assorbimento dipende rispettiva. Il contributo dei fluorofori al rispettivo coefficiente di assorbimento è stato scelto come 0,1. L'efficienza quantica è stato eletto 1. fotoni di fluorescenza rilevati da fibre ottiche vengono memorizzate separatamente per i diversi strati di tessuto e fluorofori. Inoltre, vi è stato il numero relativo di eccitazione fotone rilevato. Il numero totale di fotoni era 108 per ogni simulazione.

Per studiare l'influenza di diversi diametri dei vasi sanguigni mezzi di comunicazione nel volume del tessuto in esame, l'assorbimento del sangue come input per le simulazioni adattati. Un diametro medio dei vasi sanguigni m (S.D .. 14 m) è stato trovato da Amelink et al. per mucosa47 normale orale. Così eritrociti, diametri oltre uniformemente distribuiti dei vasi sanguigni 24, 38 e 52 e # x003BC; m sono stati simulati per coprire la gamma fisiologica. grande per ridurre l'assorbimento di sangue, in particolare a lunghezze d'onda con alto assorbimento di sangue secondo la formula descritta da van Veen et al.48 vasi sanguigni. Il coefficiente di assorbimento del 1 # x00025 risultante sangue a 425 nm è stato poi 0,413, 0,263 e 0,192 millimetri Da 1 a 24, 38 e 52 diametro del vaso m, rispettivamente; 561 nm era 0,153, 0,136 e 0,121 millimetri 1; a 576 nm è stato 0,206, 0,174 e 0,148 millimetri 1; ed a 593 nm 0,056 era, 0,054 e 0,052 millimetri 1.

L'assorbimento causato dal picco di assorbimento del sangue intorno 576 nm, il tasso di assorbimento del sangue, è stato quantificato da autofluorescenza rilevato a 561 e 576 nm. Entrambi i segnali autofluorescenza rilevato diviso per Con m sono state effettuate, il riflettore perfetta incorporati in una ghiera fibre 12 mm. Per altre simulazioni, la sonda a fibra ottica mostrato in Fig complementari. 2b è stato simulato.

Per confronto con la fluorescenza rilevata da un campione di sangue intero, il seguente simulazione Monte Carlo è stata eseguita. La sonda a fibre ottiche è stata in contatto con un campione di sangue intero spessore di 1 cm. Il sangue è stato assunto per contenere 96 ossigenato e 4 dell'emoglobina deoxygenized. La contenitore non è stato considerato per l'alta concentrazione di assorbitore. L'assorbimento del campione era 188,49 millimetri 1 (lunghezza d'onda di eccitazione, 425 nm) e 4,79 millimetri 1 (lunghezza d'onda di fluorescenza, 593 nm), rispettivamente. È stato ignorato dispersione del campione di sangue.



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